3(2H)фураноны — перспективные NSAIDs

Разработка эффективного метода синтеза противовоспалительных препаратов класса 3(2H)фуранонов способных замедлять развитие рака

Цель проекта

Проект направлен на решение проблемы разработки экономически эффективного и масштабируемого способа синтеза 4,5-диарил замещенных 3(2H)фуранонов и их аннелированных производных, с целью последующего проведения всех доклинических тестов, необходимых для получения разрешения на проведение 1-ой клинической стадии испытаний. Данные соединения проявляют высокую фармакологическую активность как селективные ингибиторы фермента циклооксигеназы-2 и могут, в перспективе, найти применение в качестве противовоспалительных препаратов (НПВП, NSAIDs) в терапии хронических заболеваний суставов, болей воспалительного генеза, а также иных болезней, ассоциированных с гиперэкспрессией COX-2.

Проблема

Актуальность поставленной задачи заключается в отсутствии коммерчески доступных сертифицированных нестероидных противовоспалительных препаратов, не вызывающих серьезных побочных явлений при их длительном применении в терапии заболеваний суставов. Препараты класса неселективных ингибиторов циклооксигеназы, такие как аспирин, ибупрофен, диклофенак, индометацин, напроксен и т.д., приводят при длительной терапии к развитию желудочно-кишечных осложнений, язв и кровотечений. Разработанные ранее препараты класса селективных ингибиторов циклооксигеназы-2, такие как целекоксиб (“Celebrex”, Pfizer), вальдекоксиб (“Bextra”, G. D. Searle&Company) при длительном применении вызывают повышенный риск сердечно сосудистых осложнений, инфаркта миокарда и инсульта. Таким образом, на сегодняшний день нет удовлетворительного решения проблемы длительной и безопасной противовоспалительной терапии ревматоидных заболеваний, а единственный разрешенный и самый безопасный препарат для длительного лечения заболеваний суставов «Целебрекс» имеет высокую цену и недостаточную эффективность.

Решение

Учитывая известную для ряда COX-2-ингибиторов зависимость типа возникающих побочных эффектов от структуры молекулы, мы предполагаем провести доклинические испытания серии соединений класса 3(2H)фуранонов, изомеры которых впервые были исследованы в 2001-2004 годах группой южнокорейских специалистов компании «Amorepacific» и которые показали высокую ингибирующую активность (COX-2) и безопасность (гастротоксичность). Однако, предложенный ими метод синтеза 4,5-диарил замещенных 3(2H)-фуранонов был мало эффективен и касался только соединений с S-содержащим фрагментом в 5-ом положении. По какой-то причине «Amorepacific» не стала продолжать исследования своих коксибов, возможно, под впечатлением от махинаций с Rofecoxib и результатов VIGOR, APPROVe и ограничилась патентованием в Южной Корее и США. Наш же проект посвящен региоизомерным 3(2H)фуранонам с S-содержащим фрагментом в 4-ом положении фуранового цикла. Нами предложен оригинальный подход к синтезу потенциальных NSAIDs класса 4,5-диарил-3(2Н)фуранонов различной сложности на основе тетразамещенных 4-диазо-диметилдигидрофуран-3(2Н)-онов. Синтетическая схема включает 6 стадий и исходит из коммерчески доступного сырья: ацетилена Фаворского (0.09 $ / 1g), тиоанизола (0.21 $ / 1g) и замещенных бензойных кислот. Так, например, синтез приводит к конечному 2,2-диметил-5-(4-(метилсульфонил)фенил)-4-фенил-3(2H)-фуранону с выходом на 6-и стадиях 42 %. Стоимость целевого продукта исходя из стоимости исходных реагентов и растворителей, в предложенной нами схеме, составляет 2 $ за 1 грамм (в альтернативных схемах: 19 $ за 1 грамм ).

Основная терапия ревматоидных заболеваний, болей различного генеза связана с применением нестероидных противовоспалительных препаратов (NSAIDs, НПВС, НПВП). Однако, длительное (более 2-3 месяцев) применение классических NSAIDs таких как аспирин, ибупрофен, диклофенак, индометацин, напроксен, нимесулид и т.д., приводит во всех случаях к развитию желудочно-кишечных осложнений, язв и кровотечений [5, 6]. Причина данных побочных эффектов заключается в неселективном ингибировании ферментов циклооксигеназы (COX, ЦОГ) 1-го и 2-го типа [7]. Из двух основных ферментов циклооксигеназы COX-1 и COX-2 за развитие воспалительного процесса отвечает только COX-2 [8], тогда как COX-1 участвует в жизненно важной регуляции секреции в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), печени и почках [9-12].

Структурное различие между геометрией активных зон ферментов COX-1 и COX-2 является стартовой точкой в разработках селективных ингибиторов COX-2. В связи с заменой изолейцина в положении 523 и изолейцина в положении 434 (в молекуле COX-1) на меньшие по объему молекулы валина приводит к образованию вторичного кармана в молекуле СОХ-2 [14]. Причем, структура цис-1,2-диарилалкенового типа оказалась идеальной для селективного ингибирования COX-2 [15-16]. Структура молекулы ингибиторов циклооксигеназы имеет важнейшее значение не только для их селективности, но и несет ответственность за развитие побочных эффектов [2].

На основании геометрий изоформ фермента СОХ, можно идентифицировать структурные элементы, которые ответственны за противовоспалительную активность разработанных лекарственных средств. Первый элемент — это цис-1,2-диарилалкеновый фрагмент как уже было сказано ранее. Большинство известных коксибов (см. формулы ниже) являются гетероциклическими соединениями, содержащими 1,2-диарильный фрагмент. Квантово-химическое моделирование структуры COX-2 c внедренной молекулой целекоксиба показало важную роль группы SO2X, так как именно арильный заместитель с данной группой может проникать сквозь гидрофильный вторичный карман, и, далее, SO2X взаимодействует с аминокислотными остатками (His-90, Arg-513, Phe-518, Gln-192) [14] блокируя активность фермента. Эксперименты подтвердили [17], что введение SO2Me или SO2NH2 группы в пара-положении фенильного кольца позволяют максимально повысить эффективность ингибирования циклооксигеназы данными соединениями.

Краткая история разработок селективных ингибиторов и литература

Результаты квантово-химического моделирования положения и конформации селективного ингибитора с цис-1,2-диарильным фрагментом внутри активного сайта фермента COX-2 [1, 2].

В конце 90-х и начале 2000-х на фармацевтический рынок были выведены многообещающие NSAIDs 2-ого поколения — селективные ингибиторы фермента COX-2. Типичные примеры: рофекоксиб (“Vioxx”, Merck), целекоксиб (“Celebrex”, Pfizer), вальдекоксиб (“Bextra”, G. D. Searle & Company), эторикоксиб (“Arcoxia”, Merck) и др. Данный класс препаратов объединяет строение молекулы действующего вещества — все это 1,2-диарилзамещенные гетероциклические соединения, содержащие в своем составе группы SO2NH2 или SO2CH3.

Позднее, в результате испытаний VIGOR [18], APPROVe [19] и других, было выяснено, что подобные препараты вызывали повышенный риск сердечно-сосудистых осложнений в сравнении с плацебо, в результате чего в 2004-2006 годах большая часть селективных ингибиторов COX-2 была отозвана с рынков. На сегодняшний день рофекоксиб, вальдекоксиб и люмиракоксиб полностью выведены с фармацевтического рынка, парекоксиб и эторикоксиб разрешены к продаже в ЕС, но не в США. Фирококсиб находит применение в ветеринарии. Самым коммерчески успешным на сегодняшний день препаратом данного остается целекоксиб, который разрешен к применению во всем мире и доход компании «Pfizer» от продаж которого по данным [20] достигал 3 млрд.$/год.

Однако, последующие широкомасштабные исследования сравнительной кардиоваскулярной безопасности NSAIDs, выполненные после запрещения рофекоксиба, показали [21], что такие классические NSAIDs как ибупрофен, диклофенак, индометацин часто превосходят селективные ингибиторы COX-2 по выраженности побочных эффектов.

[1] Song Seok Shin and coworkers, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2001, 11, 165.
[2] Song Seok Shin and coworkers, J. Med. Chem. 2004, 47, 792.
[3] “The Arthritis Society. Types of Arthritis”, http://www.arthritis.ca/facts
[4] “Институт ревматологии РАМН”, http://rheumatolog.ru
[5] Ю.В. Муравьев, и др., Российский Гастроэнтерологический журнал, 2000, №4.
[6] Е.Л. Насонов, Consilium Medicum, 1999, том 1, № 5.
[7] J.L. Masferrer, B.S. Zweifel, K. Seibert, P. Needleman, J. Clin. Invest. 1990, 86, p. 1375.
[8] J.R. Vane, R.M. Botting, Inflammation Res. 1998, 47, 78.
[9] D.L. Dewitt, Mol. Pharmacol. 1999, 4, 625.
[10] L.J. Marnett, A.S. Kalgutkar, Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 482.
[11] C.J. Hawkey, Lancet 1999, 353, 307.
[12] J.R. Vane, R. Botting, “Clinical Significance and Potential of Selective COX-2 Inhibition” William Harvey Press, London, 1998.
[13] RCSB Protein Data Bank, http://www.rcsb.org.
[14] P.N. Praveen Rao, E.E. Knaus, J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2008, 11, 81.
[15] P. Prasit, D. Riendeau, Ann. Rep. Med. Chem. 1997, 32, 211.
[16] X.D. Leval et al., Expert. Opin. Ther. Patents 2002, 12, 969.
[17] J.J.Talley, Prog. Med. Chem. Res. 1999, 36, 201.
[18] Bombardier, Laine, Reicin et al., N. Engl. J. Med. 2000, 343, 1520.
[19] R.S. Bresalier, R.S. Sandler, H. Quan et al., N. Engl. J. Med. 2005, 352, 1092.
[20] Meghan Foley “Here’s Why Pfizer’s Holding on to Its Celebrex Patent With Both Hands”, http://www.cheatsheet.com, 2014.

COX-1 (protein database)

COX-2 (protein database)

При этом анальгетическое действие более выражено у коксибов, степень опасности которых, в целом, является переоцененной [22-23]. Ниже приведены иллюстративные диаграммы (Рис. 3) мета-анализа статистических данных по различным типам осложнений при лечении противовоспалительными препаратами, из которых следует, что напроксен – наиболее безопасен, а диклофенак и ибупрофен, в целом, являются более опасными, чем запрещенный к продаже рофекоксиб. Целекоксиб по степени безопасности для здоровья приближается к напроксену, но в отличии от последнего, не дает осложнений на ЖКТ.

 

 

 

Сейчас интерес фармацевтических компаний возвращается к разработкам синтеза и клиническим испытаниям селективных ингибиторов COX-2, например, в новом качестве противораковых препаратов в составе комплексной иммуно- и химиотерапии. Результаты первичных доклинических испытаний противовоспалительной активности некоторых соединений класса коксибов, представляющих из себя замещенные 3(2H)фураноны, проведенные учеными Южнокорейской корпорации “Amorepacific”, показали, что сходные по структуре с целекоксибом производные 2,2-диметил-5-(4-(метилсульфонил)фенил)-4-арил-3(2H)-фураноны также являются эффективными селективными ингибиторами COX-2 [1-2].

Согласно данным этих авторов, ряд производных 3(2H)-фуранонов проявляют в 10 раз большую in vitro активность ингибирования COX-2 фермента, чем целекоксиб и рофекоксиб (Рис 4). Введение неполярных и гидрофобных групп (алкил, галоген, арил) в фенильное кольцо в 4-ом положении фуранового цикла, повышает активность соединения, тогда как полярные группы (ацетокси, метокси), в тех же условиях, снижают активность вещества. Кроме того, как было показано, не только 3(2Н)-фураноны, содержащие SO2Me (или SO2NH2) группу могут быть использованы как ингибиторы циклооксигеназы-2, но и их пролекарственная сульфоксидная форма (“prodrugs”) A, которая несмотря на свою меньшую активность в организме легко превращается в активную сульфоновую форму B в результате нормального метаболизма [24]. Несмотря на меньшую активность, сульфоксид имеет существенно большую биодоступность, что приводит к снижению риска осложнений в связи с передозировкой.

Механизм действия противовоспалительных средств

В отличие от более эффективных глюкокортикостероидных препаратов (кортизона ацетат, преднизолон), NSAIDs (non steroidal anti-inflammatory drugs) вмешиваются в более позднюю стадию биосинтеза простагландинов (гормонов млекопитающих с широким спектром физиологического действия), и в меньшей степени вызывают нежелательные побочные эффекты [5-6]. Вот почему в последние годы наблюдаются высокие темпы роста сектора исследований в области NSAIDs, проводится поиск новых, более эффективных и безопасных препаратов.

В организме человека присутствует как минимум две изоформы фермента циклооксигеназы («простагландинсинтаза») – COX-1 и COX-2. Существование COX-3 в организме и его роль в настоящее время обсуждается. COX-1 присутствует в нормально функционирующем организме и включен в синтез простагландинов, участвующих в регуляции функций почек, желудка, кишечника и работе гладкой мускулатуры внутренних органов. Вторая изоформа активно синтезируется в воспаленных клетках. Принцип действия NSAIDs заключается в селективном или неселективном ингибировании фермента циклооксигеназа-2 (COX-2), участвующего в синтезе простагландинов в воспаленных участках тканей.

Неселективное ингибирование СОХ-1 и СОХ-2 приводит к тому, что резко увеличивается доля метаболизма АА по лейкотриеновой ветви, что нарушает естественный баланс лейкотриенов и простагландинов. Локальное накопление лейкотриенов может порождать бронхоспазм и сужение кровеносных сосудов (рост АД). Тем не менее, широкое применение АСК в медицине как жаропонижающего, противовоспалительного и антиагрегатного средства обосновано экспериментально доказанным невысоким риском развития серьезных осложнений с возможностью его предупреждения. Это одна из причин, почему спустя 15 лет после открытия, селективные ингибиторы (коксибы) занимают лишь 5 % фармацевтического рынка NSAIDs в мире, уступая неселективным ингибиторам. Риск осложнений при нарушении баланса лейкотриенов и простагландинов оказывается, в целом, незначительным.

[21] Sven Trelle et al., BMJ 2011, 342,7086.
[22] Svetla Gadzhanova, et al., Drugs Aging 2013, 30, 23.
[23] Meheroz, Rabadi et al., Ann Indian Acad Neurol. 2013, 16 (1), 47.
[24] J. H. Moh et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 1757.
[25] J. A. Mitchell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90, 11693.
[26] «Биохимия: Учебник для вузов», Под ред. Е.С. Северина., 2003, 417.
[27] С. Ю. Штрыголь, Провизор 2005, 2.
[28] G.A. Fitzgerald, C. Patrono, N. Engl. J. Med. 2001, 345, 433.
[29] D. Maslinska et al., Folia Neuropathol. 1999, 37, 287.
[30] M. Komhoff et al., Kidney Int. 2000, 57, 414.
[31] M.G. Belvisi et al., Br. J. Pharmacol. 1998, 125, 1102.
[32] M. Katori, M. Majima, Inflamm. Res. 2000, 49, 367.
[33] A.M. Simon et al., J. Bone. Miner. Res. 2002, 17, 963.
[34] L.R. Ballou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 10272.
[35] S.G. Morham et al., Cell 1995, 83, 473.
[36] B.F. McAdam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 272.
[37] A.G. Herman, S. Moncada, Eur. Heart J. 2005, 26, 1945.
[38] J.L. Wallace, L.J. Ignarro, S. Fiorucci, Nat. Rev. Drug. Disc. 2002, 1, 375.
[39] T. Csont, P. Ferdinandy, Pharmacol. Ther. 2005, 48, 4061.
[40] C. Charlier, C. Michaux, Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 645.
[41] M.A. Palladino et al., Nat. Rev. Drug Disc. 2003, 2, 736.
[42] J.R. Brown, R.N. DuBois, JCO 2005, 23, 2840.
[43] L.W.C. Chow, W.T.Y. Loo, M. Toi, Biomed. & Pharm. 2005, 59, 281.
[44] S. Gadzhanova, J. Ilomaki, E.E. Roughead, Drugs Aging, 2013, 30, 23.
[45] Ю.Ю. Медведев “Разработка нового подхода к синтезу тетразамещенных 3(2Н)-фуранонов”, дипломная работа специалиста, 2011.

Рис. 5. Пути метаболизма арахидоновой кислоты в организме. TXA, PGE, PGF, PGD, PGI синтазы – ферменты переводящие субстраты PGG2 и PGH2 в соответствующие простагландины [26].

Рис. 6. Ацилирование гидроксила Ser530 циклооксигеназы ацетилсалициловой кислотой (АСК).

Иным способом вмешательства в биосинтез PGs является применение селективных NSAIDs, таких как целекоксиб (Celebrex®, Pfizer), которые селективно ингибируют фермент СОХ-2, концентрация которого может возрастать в 10-80 раз под действием стимулирующих факторов, что резко увеличивает синтез простагландинов, участвующих в механизме воспаления [27]. Важно отметить, что в случае NSAIDs крайне важны обе характеристики – как селективность, так и эффективность. Ведь ингибирование СОХ-1 приводит к торможению синтеза биологически важных простагландинов, в том числе и регулирующих функции почек и желудка, что может привести к нарушениям функции ЖКТ, в том числе к желудочным язвам, кровотечениям и развитию рака желудка. Именно поэтому требуются препараты с высоким значением IC50 для СОХ-1 (параметра, численно равного концентрации лекарственного препарата, при которой наблюдается 50-ти процентное ингибирование фермента), тогда как значение IC50 для СОХ-2 должно быть как можно ниже. Это связано с процессами метаболизма вещества в организме, а также с соответствующими параметрами для изоформ СОХ, характеризующими селективность препарата. Кроме того, экономический фактор также требует снижения эффективной дозы препарата, а значит повышения его удельной эффективности на единицу массы. Так, например, эффективная дозировка рофекоксиба составляла 25 мг, тогда как для целекоксиба она в 10 раз больше и равна 200 мг действующего вещества.

Кардиоваскулярная безопасность коксибов

Основной проблемой и риском, с которым сталкиваются разработчики потенциальных селективных ингибиторов COX-2 – это риск развития неконтролируемой агрегации тромбоцитов, возникновения сердечно-сосудистой недостаточности, инсульта и инфаркта миокарда. Есть несколько теорий о происхождении сердечно-сосудистого риска, связанного с длительным использованием селективных ингибиторов COX-2. Прежде всего, дифференциация COX-1 и COX-2 ферментов, как «конститутивной» и «индуцибельной» форм COX по-видимому несостоятельна [28]. Недавно было установлено, что СОХ-2, конститутивно экспрессируется в некоторых видах тканей [29-30], а также играет защитную роль при астме [31] и может принимать постоянное участие в некоторых функциях организма в целом [32-33]. Так что, полное ингибирование COX-2 может привести к нарушению функций организма [34].

Вторая теория относится к различию между траекториями развития воспаления типа «СОХ-2» и «СОХ-1». СОХ-1 фермент отвечает за формирование про-агрегатного агента тромбоксана A2 (TxA2), который вызывает вазоконстрикцию и стимулирует агрегацию тромбоцитов. СОХ-2 катализирует синтез анти-агрегантного простагландина PGI2 [35-36]. Коксибы, в общем случае, вызывают уменьшение уровня PGI2, в то время как уровень ТхА2 остается постоянной. Таким образом, селективные ингибиторы СОХ-2 нарушают естественный баланс между ТхА2 и PGI2, что может привести к увеличению сердечно-сосудистых осложнений. Однако, поскольку влияние коксибов в каскаде арахидоновой кислоты распространяется не только на COX-пути, но и косвенно также на LOX и CYT-Р450 траектории, можно предположить, что четкая связь между спецификой селективных ингибиторов COX-2 и риском сердечно-сосудистых событий не будет выявлена экспериментально, что было подтверждено недавними исследованиями [21].

В связи с тем, что как традиционные НПВС, так и селективные ингибиторы циклооксигеназы, вызывают нежелательные побочные эффекты при длительном применении, существует большая потребность в разработке противовоспалительных препаратов с пониженным риском развития желудочно-кишечных осложнений, и, одновременно, с низким риском сердечно-сосудистых заболеваний, таких как инфаркт миокарда и инсульт. НПВП, содержащие группы NO-доноров (NO-NSAIDs) являются хорошей альтернативой традиционным противовоспалительным препаратам благодаря ожидаемому снижению количества побочных эффектов, так как молекулы оксида азота, как известно, защищают слизистую ЖКТ [37-38]. Тем не менее, длительное лечение препаратами типа NO-NSAIDs может вызвать «нитратную толерантность», что снижает эффективность препаратов [39]. Кроме того, исследовались также двойные ингибиторы COX/5-LOX [40] и препараты анти-TNF-терапии [41], однако, до сих пор эти исследования не привели к созданию универсальных препаратов для длительной терапии боли воспалительного генеза без побочных эффектов.

Тем не менее, селективные ингибиторы СОХ-2 весьма интересны, в частности, из-за их возможного использования для лечения и профилактики рака [42-43]. Кроме того, для пациентов с высоким риском желудочно-кишечных осложнений, в случае необходимости длительной терапии артрита, рекомендовано применение именно ингибиторов СОХ-2 [44]. Таким образом, разработка новых эффективных и максимально безопасных селективных ингибиторов COX-2 является актуальной научно-технической задачей.

Применение в качестве препарата для лечения домашних животных


Как и многие другие коксибы, запрещенные FDA к продаже в качестве лекарств человека, 3(2H)-фураноны могут также найти свое применение в ветеринарии, так как большинство из имеющихся на российском рынке препаратов являются импортными, и по цене не уступают лекарствам для лечения людей.

Ветеринарное направление интересно прежде всего с точки зрения низких затрат на вывод препарата на рынок — от 1 до 10 млн. $, так как нет необходимости в клинических испытаниях как таковых. Испытания на собаках крупных пород и кошках могут быть включены в состав поздней доклиники.

Наиболее известные препараты для лечения артрита у собак и кошек: «римадил» (капрофен, Pfizer), «аубикал» (салицилат), диклофенак, «норокарп» (капрофен), «Deramaxx» (деракоксиб, Novartis) и другие.